(1)安裝電泳管

選擇聚含均勻、無氣泡、無裂縫、膠面平整并與管壁沒有脫離現(xiàn)象的合格凝膠電泳管 插入上電極槽底板的各圓孔中，留1/5在底板上方，保證使電泳管與底板垂直，密封處不 致滲漏。

(2) 加樣

可利用上述方法制成樣品膠，也可以用如下的一種方法加樣。

將樣品溶于200mg/ml濃度的蔗糖溶液中，或溶在10%甘油中，然后加在濃縮膠的 表面。

或?qū)⑷刍沫傊c樣品溶液混合后加在濃縮膠表面。

或用與電泳管內(nèi)徑相近的圓形厚濾紙片，將樣品溶液吸收后，緊貼在濃縮膠表面。 如樣品是固體，應(yīng)先溶在濃縮膠緩沖液中，并加入足夠量lmol/L的蔗糖溶液，使樣 品溶液的比重增大，再加在濃縮膠表面.

加樣體積一般不超過100山常用雖為20?50山 含量不超過100昭,常用量為20? 5外拿如果樣品是一個多組分的混合物，加樣量可增加到200_Mgo如果樣品是一種抽提液, 必須去除有形顆粒，取可溶部分上樣。

必須保證樣品溶液具有低電導(dǎo)性，鹽濃度不應(yīng)超過0. 05mol/L_o

目前常用的加樣方法是：用稀釋5-10倍的濃縮膠緩沖液，使其成lmg/ml的濃 度，再加蔗糖使成濃度，然后在濃縮膠面上有電極緩沖液存在的情況下，用合 適的加樣工具如微堇注射器，插入濃縮膠面與上方的電極緩沖液界面處，輕輕地將樣品加 在濃縮膠面上.

(3) 加電極緩沖液

樣品加入后，在上下兩個電極槽中灌注電極緩沖液，緩沖液的溫度需與電泳溫度一 致。加入緩沖液時應(yīng)小心操作，不能攪動電泳管中的樣品溶液，并不使電泳管上下口留有 氣泡。緩沖液的用垃隨容器的大小而有異。一般情況下電極槽中的緩沖液量能使電泳管 至少有3/5浸入緩沖液為宜。

(4) 加指示染料

對于誠性系統(tǒng)常用的指示染料為0. 001%漠酚藍(lán)，酸性系統(tǒng)常用的是0. 005%甲基綠 或甲烯藍(lán)。用量為每500ml緩沖液加指示染料1ml_D 一般加在上電極槽緩沖液中。

另有一種辦法是將染料配制成0. 1%濃度的溶液，每管加5貝，與樣品溶液混合后加 入。

(5) 電泳

裝配好電極，接通直流電源。堿性系統(tǒng)上電極接負(fù)極，酸性系統(tǒng)上電極接正極。

對于直徑5?7mm的凝膠，最初2分鐘用1mA/管的電流進(jìn)行電泳，然后逐漸升高到 2?5mA/管（10分鐘）。通常5mm X 65mm的凝膠在20 C時用4mA/管進(jìn)行電泳,大約需

時40分鐘。

在電泳過程中，常要求電流保持恒定。此時，電壓會有升高。如果電流大而產(chǎn)生過高 的歐姆熱，影響某些樣品時，可以降低電流而延長電泳時間。

可以看岀，由于水的電解在負(fù)極產(chǎn)生H2,在正極產(chǎn)生1/2 O2,同時,HA不斷消耗。從 兩個電極反應(yīng)可以知道：為了保持緩沖液有幾乎不變的緩沖能力，上下電極槽必須足夠 大，以盛放足夠量的緩沖液。

有時候，我們需要進(jìn)行長時間的電泳。例如:DNA的分離有時長達(dá)10余小時。為了防 止由于電極反應(yīng)使緩沖能力耗盡從而引起pH的變化影響分離，1977年美國匹茲堡大學(xué) T.G. Cooper提出用循環(huán)緩沖液的辦法來保持緩沖能力不致耗盡，以達(dá)到緩沖溶液能較 長期使用的目的。

Cooper的循環(huán)緩沖液方法示意見圖2-3_o

上下兩個電極槽的緩沖溶液水平保持恒定，但又沒有建立通路。下槽的緩沖液可靠輸 液器一滴一滴地滴入上槽。而當(dāng)上槽的緩沖液增加時，就會經(jīng)溢流管滴回到下槽，使上下 兩槽的緩沖液水平在電泳過程中始終保持恒定。要注意的是,滴入上槽中的緩沖液，必須 不是線狀連續(xù)的。

凝膠的取出

電泳結(jié)束取出電泳管。然后,用配有細(xì)長針頭并盛有水的注射器，將針頭小心地插入 凝膠和玻璃管壁之間，邊插入轉(zhuǎn)動管子同時壓進(jìn)一些水，另一端也作同樣處理。然后，將管

F套上橡皮管用自來水壓力壓出凝膠，或用洗耳球壓岀凝膠。如果壓岀凝膠困難時，注射 器內(nèi)可裝甘油代替水壓入凝膠和管壁之間。也可以用一根金屬細(xì)絲，從凝膠和管壁之間穿 過整個玻璃管，然后，拉緊金屬細(xì)絲轉(zhuǎn)動玻璃管一周，就能使凝膠脫離管壁，再用洗耳球擠 壓，就很容易壓出。

也可以將電泳管浸入甲醇中，使凝膠收縮與管壁脫離而取岀，或根據(jù)具體條件用別的 辦法取出凝膠。但必須注意，無論用何種辦法，必須不損傷膠面。特別是濃度低的大孔凝 膠，宙「機(jī)械強(qiáng)度差，取岀時應(yīng)格外小心。

凝膠的染色——分離區(qū)帶的檢出

(1)蛋白質(zhì)的一般染色方法

固定和染色常可同時進(jìn)行。因為，染料的溶劑一般就是固定劑.常用的幾種染色方法 簡述如下：

(i) 氯基黑10B (amido black 10B)用7%的醋酸配制0. 5%?1%的染料溶液，浸 染2?6小時，染色后用水洗。

用7%的醋酸配制1%的染料溶液,96 C保溫染色10分鐘，可以改善對弱區(qū)帶的分辨 率。

(ii) 考馬斯亮藍(lán) R-250 (Coomassie brilliant blue R-250)先用 12. 5%三氯醋酸固 定數(shù)小時，出現(xiàn)白色沉淀條紋后，在三氯醋酸中滴加少量1 %考馬斯亮藍(lán)R-250溶液，過 夜，用此法染色底色很淺，通常染色后不需脫色。

或用0. 25%考馬斯亮藍(lán)R-25O的甲醇-醋酸混合液(454ml 50%的甲醇+ 46ml冰醋 酸)染色2-10小時。

或先用20%磺基水楊酸固定18小時，然后用0. 25%考馬斯亮藍(lán)R-25O的無重金屬 離子的水溶液染色0. 5?2小時?；蛴?/span>0. 25%考馬斯亮藍(lán)R-250的9%醋酸和45%甲醇 混合液染色0. 5-2小時。

(iii) 考馬斯亮藍(lán)G-250先在5%三氯醋酸中固定30分鐘，水洗幾次，然后用1% 該染料的7%醋酸溶液，染色10分鐘?；蛴?/span>0.1%該染料的甲醇:水：醋酸(10 ： 10 ： 1 v/v)混合液，染色30分鐘。

(iv) 固綠(fast green)用1%固綠的7%醋酸溶液，染色2小時。最好在10C以下進(jìn) 行₀

(v) 普施安亮藍(lán)RS (Procion brillant blue RS)先在20%磺基水揚(yáng)酸固定0. 5?2 小時，然后用1%該染料的10%醋酸和50%甲醇混合液染色1?2小時。

(vi) 1%考馬斯亮藍(lán)R-250溶劑是水：甲醇：冰醋酸(5 : 5 ： 2),使用前用濾紙 過濾去除不溶物。柱狀凝膠條室溫染色至少4小時。1.5mm厚的平板凝膠，室溫染色4? 6小時。

(vii) 硫酸銅-考馬斯亮藍(lán)混合染色液10g硫酸銅定溶于800ml蒸偕水中，再加入 200ml醋酸作為染色貯備液A。

3g考馬斯亮藍(lán)G-25O溶于900ml甲醇中，再加蒸饞水至1 000ml作為染色貯備液B。 使用前等體積攪拌混合貯備液A和染色30分鐘至數(shù)小時視不同樣品而異。

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